Питер Болтон, Мэри Дайсон и Стив Янг
Отделение Исследования Восстановления Тканей, Подразделение Анатомии и Клеточной Биологии, Объединенные Медицинские и Зубоврачебные Школы Guy's и St.Thomas's Больница Guy's/London SEl 9RT. UK
Макрофаги являются источником многих важных медиаторов, участвующих в заживлении ран. Макрофагообразные клетки клеточной линии были подвергнуты in vitro облучению одним или двумя источниками света с разными уровнями поляризации (95% и 14%). Время облучения, 60 и 120 с, было подобрано так, что плотность энергии излучения составляла 1,44 и 2,88 Дж/см 2 у каждого источника света. Были облучены и другие, контрольные группы клеток. Через двадцать часов после облучения обусловленный макрофагами субстрат был помещен на монослой ЗТЗ фибробластов. Разрастание фибробластов оценили через 4 дня. Пролиферативная реакция была наиболее сильной у культур, на которые были помещены супернатанты макрофагов, облученных светом, поляризованным на 95%. Время облучения 120 с было более эффективным, чем 60 с.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: клеточная линия U-937, поляризованный свет, фактор роста клеток
Введение
Факторы роста, которые синтезируются и выделяются макрофагами, могут повлиять на деятельность многих типов клеток 1-4 . Уже было показано, что облучение светом различных длин волн и плотности энергии тоже может вызвать выделение макрофагообразными клетками U-937 растворимых факторов, и стимулирующих, и ингибирующих разрастание фибробластов 5-7. Целью этого исследования было сравнение действия света различных степеней поляризации на данную деятельность макрофагов.
Макрофагообразная клеточная линия U-937 8 , как было показано, выделяет растворимые факторы, стимулирующие митогенную активность выращенных фибробластов. Она обладает многими характеристиками нормального человеческого макрофага и, как мы считаем, пригодна для использования в качестве модели в настоящих исследованиях. Линия уже использовалась в более ранних исследованиях, демонстрирующих действие различных параметров света на выделение факторов.
Материалы и методы
Используемыми фототерапевтическими устройствами были источники поляризованного света Bioptron ™ . Обе лампы были откалиброваны при помощи спектрорадиoметра "Oriel" с двойным монохроматором, включающим фотоувеличитель повышенной UV-активности, и с кварцевым рассеивателем диаметром 2,5 см, размещенным впереди.
Физические характеристики источников света
Источник света А (а) Длина волны: 400-2000 нм. (b) Средняя выходная мощность: 5,772 Вт. (с) Степень поляризации 95%.
Источник света В (а) Длина волны: 400-2000 нм. (b) Средняя выходная мощность: 17,316 Вт. (с) Степень поляризации: 14%.
Дозиметрия
Поскольку мощность источников света была различной, было необходимо менять дистанцию облучения, чтобы обе лампы излучали на клетки энергию одинаковой плотности. В данном случае лампа, излучавшая более поляризованный свет, была расположена на расстоянии 25 см от клеточных культур, в то время как лампа, излучающая менее поляризованный свет, была расположена на расстоянии 145 см от клеток. Это дало плотность энергии равную 1,44 Дж/см 2 для обеих ламп, за время облучения 60 сек. и плотность энергии 2,5 Дж/см 2 за время облучения 120 сек. В o6oих случаях площадь облучаемых клеток равнялась 25 см 2 .
Клеточная культура
Клетки U-937 . Клетки U-937 были выращены в субстрате RPMI 1640 (Life Technologies) [LT], дополненном 1% пенициллина стрептомицина [LT] и 10% активированной нагреванием сывороткой эмбриона теленка [FCS] [LT]. Клетки были субкультивированы каждые 2 дня. Они выращивались при температуре 37 °С с 5%-ным содержанием СО2 в атмосфере в колбах по 50 мл, каждая из которых содержала 9 мл субстрата плюс клетки. Каждая колба после сливания содержала приблизительно 9x10 6 клеток.
Фибробласты . Использовались фибробласты Swiss 3T3 из Европейской Коллекции Животных Клеточных Культур (ЕСАСС № 85022108) Porton Down. Они были выращены в Минимальной Необходимой Питательной среде Dulbecco (DMEM [LT]), дополненной 1% пенициллина стрептомицина и 10% сыворотки эмбриона теленка (FCS [LT]), при температуре 37 °С и 5% СО2 в атмосфере. Культуры были слиты через 3 дня после пересева. После сливания каждая колба содержала приблизительно 3-4 х 10 6 клеток. Излишки субстрата были вылиты из колб, а клетки промыты фосфатным буферным солевым раствором. В каждую пробирку добавили 5 мл 25%-ного трипсина, так, чтобы он закрыл слой клеток, и оставили на 30 сек. Затем лишний трипсин был вылит, а колбы в термостате опрокинуты, чтобы поверхность, покрытая клетками, была наверху, и оставшийся трипсин не находился в контакте с клетками. Это предотвратило вред, который остатки трипсина могли нанести клеткам. Через 10 мин. клетки отделились. В каждую колбу добавили 3 мл DMEM и, образовавшуюся клеточную суспензию вылили в общий сосуд и тщательно перемешали. При помощи пипетки клетки по 50 мкл разлили в ячейки 96-ячеечной микропластины. Каждая ячейка содержала примерно 1000 клеток. В каждую ячейку добавили 50 мкл DMEM, после чего объем в каждой ячейке стал составлять 100 мкл.
Облучение U-937
После сливания клетки U-937 были суспендированы и перелиты в стерильные 50-мл колбы (Life Technologies) в объемах по 10 мл при плотности клеток 10 6 /мл. В колбы добавили свежего RPMI. Каждую колбу подвергли как (а) симулированному облучению, так и (b) облучению светом, поляризованным на 95% и (с) светом, поляризованным на 14% (Рис. 1). Немедленно после облучения клетки на 12 ч поместили в термостат с температурой 37 °С. Затем клетки были центрифугированы в течение 5 мин. со скоростью 500 оборотов в минуту. Обусловленный макрофагами супернатант удалили и оставили храниться при температуре -20 °С.
Тест макрофагов на жизнеспособность
ерез 20 часов после обработки из каждой группы были взяты образцы макрофагов и помещены в стеклянную пробирку, куда были добавлены 0,5 мл трипанового синего (0,4% объемных единиц). Затем образцы поместили в счетную камеру Ньюбауэра и проверили их жизнеспособность.
Анализ разрастания фибробластов
Все супернатанты были протестированы на их действие на пролиферацию фибробластов при помощи теста метиленового синего, описанного Мартином и др. 11 и проверенного Оливером с соавт. 12 . Для каждого из следующих периодов времени использовалось по одной микропластине: нулевое время, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после посева. Каждая микропластина соответствовала образцу на рис. 2. В конце каждого периода времени одна из 5 пластин приготовлялась для считывания данных при помощи спектрофотометра в следующем порядке:
(1) Клеточный субстрат был удален.
(2) Клетки были трижды промыты буферным раствором соли тетраборной кислоты (рН 8,6, 0,01 м).
(3) В каждую ячейку были добавлены 100 мкл 100%-ного метанола и оставлены на 4 минуты, чтобы зафиксировать клетки.
(4) Лишний метанол был удален, и клеткам дали высохнуть.
(5) В каждую ячейку были на 30 мин. добавлены 100 мкл 1%-ного метиленового синего.
(6) Лишний метиленовый синий был удален, и каждую ячейку 3 раза промыли буферным раствором соли тетраборной кислоты.
(7) В каждую ячейку добавили 100 мкл кислого алкоголя, и микропластину взболтали, чтобы обеспечить полное смешение вымытого красителя с кислым алкоголем.
Затем микропластины были помещены в восьмиканальный спектрофотометр Anthos (TechGen), и поглощающая способность содержимого каждой ячейки была считана на длине волны 650 нм. После того, как микропластины были исследованы спектрофотометром, поглотительную способность сравнили со стандартным графиком, чтобы определить число клеток в каждой ячейке.
Результаты
Жизнеспособность клеток U-937
По результатам теста трипанового синего на жизнеспособность, через 12ч после обработки число клеток U-937 во всех группах колебалось между 93 и 95% от первоначального числа в каждой группе. Не было статистически значимой разницы между клетками, облученными светом, поляризованным на 95%, светом, поляризованным на 14%, и контрольными группами, подвергнутыми симулированному облучению. Не имело значения и время облучения.
Количественный анализ разрастания фибробластов
В таблице 1 показано изменение числа фибробластов с истечением данных промежутков времени, а в таблице 2 -статистический анализ этих данных. На рис. 3 проиллюстрировано действие по разрастанию фибробластов, обусловленное макрофагами супернатанта, полученного из клеток U-937, обработанных in vitro источниками света, поляризованного на 95% и на 14% (LA и LB). Точки графика соответствуют количеству фибробластов через данный промежуток времени после добавления супернатанта. Через 96 сек после посева число клеток было большим в тех популяциях, которые подверглись воздействию супернатанта макрофагов, облученных в течение 60 и 120 сек. светом, поляризованным на 95%, чем в тех, которые подверглись воздействию супернатанта макрофагов, облученных в течение тех же промежутков времени светом, поляризованным на 14%. Самая большая разница между действием 95% и 14% поляризованного света наблюдалась после 120 сек облучения. Пролиферация была большей у фибробластов, подвергнутых воздействию супернатанта макрофагов, обработанных светом, поляризованным на 95%, в течение 120 сек.
В противоположность этому, когда время облучения светом, поляризованным на 14%, увеличили с 60 до 120 сек, разрастание фибробластов уменьшилось (рис. 3), однако, оно было значительно больше, чем у контрольных клеток, облучаемых симулированным излучением.
Обсуждение
Полученные результаты позволяют предположить, что облучение клеток U-937 поляризованным светом вызывает выделение этими клетками веществ, предположительно факторов роста, стимулирующих пролиферативную активность фибробластов.
Кроме того, уровень поляризации влияет на уровень стимуляции. Из двух промежутков времени лучшим для облучения 95%-но поляризованным светом оказался промежуток 120 сек, а для облучения 14%-но поляризованным светом - 60 сек. Согласно предположению, такое свойство света, как поляризация, вызывает количественное увеличение отрицательных зарядов на поверхности облучаемых эмбриофибробластов человека 13 . В противоположность этому, в исследовании влияния неполяризованного света на количество отрицательно заряженных связывающих участков на мембранах клеток, это влияние было немногим сильнее действия симулированного излучения.
Данные изменения мембраны гораздо более значительны под влиянием поляризованного света, чем под влиянием неполяризованного света 13 . Эти наблюдения позволяют предположить, что активное участие клеточной мембраны в процессе биостимуляции светом существенно. В пользу этой точки зрения говорит очевидность возрастания проницаемости мембраны для ионов кальция после того, как макрофагообразующие клетки подвергли низкоуровневой лазерной терапии (LLLT ) 7 .
Обработка клеток U-937 in vitro поляризованным светом оказалась эффективным средством и (1) стимуляции выделения факторов роста, стимулирующих рост фибробластов, и (2) изменения питательных свойств субстрата облучаемой культуры, также как и (3) того и другого, вместе взятых. Превышение облучения возможно, т.к. в данной in vitro модели увеличение времени облучения светом, поляризованным на 14% вызвало ослабление стимулирующего действия, хотя оно было сильнее, чем у симулированного излучения. Оптимальное время облучения светом этих и других уровней поляризации не определено. Последняя in vitro работа показала, что облучение клеток U-937 светом определенных длин волны, плотности энергии и удельной мощности может изменить их способность влиять на разрастание фибробластов 5-7, 22 , и от этих параметров зависят и тип, и степень этого изменения. Ввиду полученных результатов мы указали соответствующие исследования, касающиеся света различной поляризации.
Благодарности
Данное исследование спонсировалось компанией Bioptron AG (Швейцария). Мы благодарим профессора Мирона Л. Вольбаршта за калибровку лампы, профессора Джона Меллерио и доктора Дэвида Палмера за полезное обсуждение и информацию о дозиметрии, и профессора М. Бэрри, главу подразделения, в котором мы проводили работу.
Литература
1. Baird, L. G. and Kaplan, A. M. (1977). Macrophagc regulation of mitogen-induced blastogenesis: I. Demonstration of inhibitory cells in the spleens and peritoneal exudatcs of mice. Cellular Immunology 28 22.
2. Baird, L. G. and Kaplan, A. M. (1977). Macrophage regulation of mitogen-induced blastogenesis. II. Mechanisms of inhibition. Cellular Immunology 28 36.
3. Varesio, L. and Holden, H. T. (1980). Regulation of lymphocyte activation: Macrophage dependent suppression of T-lymphocyte protein synthesis Journal of Immunology 125, 1694-1701.
4. Unanue, E. R., Beller, D. 1. and Lu, C. 1 (1984). Anugen presentation: comments on its regulation and mechanisms. Journal of Immunology 132. 1-5
5. Young. S. R., Bolton. P., Dyson, M., Harvey. W. and Diamantopoulous, C. (1989). Macrophagc responsivencss to light therapy. Lasers in Surgery and Medicine 9, 497-505.
6. Bolton. P.. Young, S. R. and Dyson, M. (1990). Macrophage responsiveness to light therapy: A dose-response study. Laser Therapy 2(3). 101-106.
7. Young, S. R., Dyson, M. and Bolton, P. (1990). The effect of light on calcium uptake by macrophages Laser Therapy 2(2), 53-57.
8. Sundstrom, C. and Nilsson, K. (1976). Establishment and characterisation of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer 17 565-577.
9. Wharton. W., Gillespie, G. W., Russel, S. W. and Pledger, W. J. (1982). Mitogenic activity elaborated by macrophage-like cell lines act as a competence factor(s) for BALB/c-ЗТЗ cells. Journal of Cellular Physiology HO. 93.
10. Tcnnant, J. R. (1968). Evaluation of the trypan blue technique for the evaluation of cell viability. Transplantation 2, 685-694.
11. Martin, F., Martin, M., Jcannin, J. G. and Lagneau, A. (1978). Rat-macrophage mediated cytoxicity to cancer cells: Effect of cndotoxin and cndotoxin inhibitors contained in cultured medium. European Journal of Immunology 8, 607.
12. Oliver, M. H., Harrison, N. K., Bishop. J. E., Cole, P. J. and Laurcnt, G. J. (1989) A rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell plates: application for assessment of growth factors. Journal of Cell Science 92. 513-518.
13. Kubasova, Т., Fcnyo, M., Somosy, Z.. Gazso, L. and Kertesz, I. (1988). Investigations on the biological effect of polarized light. Photochemistry and Photo-biology 48(4), 5fl5-509.
14. Boder, G. В., Kleinschmidt, W. J., Harley, R. J. and Williams. D. C. (1983). Visible light inhibits growth of Chinese hamster ovary cells. European Journal of Cell Biology 31. 132-136. ! 15. Kara, T. I. (1987). Photobiological fundamentals of low power laser. Journal of Quantum Electronics 23, 1703-1717.
16. Ehrlich, M., Kaplan, M., Bcn-Basat, S., Belkin. M. and Schwartz, M. (1988). Low energy laser irradiation and the consequences of neural trauma. Lasers in the Life Sciences 2(4), 329-331.
17. Mester. E. Mester, A. F. and Mester, A. (1988). The biomedical effects of laser application. Lasers in Surgery and Medicine 5, 31-39.
18. Mester, E., Spiry, Т., Szende. B. and Tola, J. G. (1971). Effects of laser rays on wound healing. American Journal of Surgery 122. 532-535.
19. Dyson, M. and Young, S. (1986). Effect of laser therapy on wound contraction and cellularity on mice Lasers in Medical Science I. 125-130.
20. Basford, J. (1986). Low-energy laser treatment of pain and wounds: hype, hope or hokum? Mayo Clinical Proceedings 61, 671-675.
21. England, S. (1989). Low power therapy of shoulder tendonitis. Scandinavian Journal of Rheumatology 18, 427-431.
22. Bolton, P. A., Young, S. and Dyson, M. (1991). Macrophagc responsiveness to laser therapy with varying power and energy densities. Laser Therapy 3 (3) 105-111.